Влияние тетрапептида на течение экспериментального сахарного диабета

При анализе аминокислотных последовательностей инсулинотропных полипептидов обнаружен общий для них короткий участок из четырех аминокислотных остатков. Синтезирован тетрапептид KEDWa, аналог этого участка, защищенный от действия протеиназ желудочно-кишечного тракта. Применение тетрапептида внутримышечно в течение 11 сут при аллоксановом диабете у крыс способствует частичному восстановлению синтеза инсулина. Наклон сахарной кривой при этом аналогичен наклону сахарной кривой здоровых животных. При введении тетрапептида перорально либо внутримышечно в течение 10 сут крысам с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом установлено, что при пероральном применении тетрапептид обладает выраженным гипогликемическим действием в период приема. При внутримышечном введении тетрапептид нормализовал адгезивность эндотелия микрососудов брыжейки, не влияя на проницаемость. Полученные результаты свидетельствуют о наличии гипогликемического и эндотелиопротекторного действия тетрапептида при экспериментальном сахарном диабете. Предложена гипотеза, что тетрапептид является активатором промотерного участка гена препроинсулина, комплементарно взаимодействуя с нуклеотидными последовательностями ggcagg и cctgcc ведущей цепи двойной спирали ДНК.

Сахарный диабет (СД) занимает третье место в мире по распространенности после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. СД характеризуется абсолютной или относительной недостаточностью инсулина, постоянной повышенной концентрацией глюкозы в крови и нарушением всех видов обмена веществ. Наиболее частой причиной инвалидизации и смертности больных СД являются диабетические ангиопатии — генерализованное повреждение кровеносных микрососудов, сочетающееся с нарушением гемостаза [1, 4, 12]. Известно, что при СД развиваются системные нарушения функции органов, обусловленные состоянием микроциркуляции и транскапиллярного обмена, ключевую роль в регуляции которых играет эндотелий. Пусковым механизмом развития эндотелиальной дисфункции при СД являются метаболические нарушения, в первую очередь гипергликемия [20]. Диабетическая гипергликемия способствует увеличению синтеза мукополисахаридов, что приводит к повышению их уровня в сыворотке крови и отложению в микрососудах почек, сетчатки глаза и других органов. При дефиците инсулина превращение глюкозы в инсулинозависимых тканях происходит, главным образом, по полиольному пути с активацией фермента альдозоредуктазы, в результате чего в сосудистой стенке, хрусталике глаза, нервах и почках накапливается сорбитол и фруктоза в повышенных осмотически действенных концентрациях. Являясь гидрофильными, эти продукты полиолов способствуют развитию гидропического отека клеток и нарушению активного транспорта веществ через мембраны [1]. Высокая концентрация глюкозы ведет также к неферментативному гликозилированию белков, липидов и других компонентов сосудистой стенки, что изменяет их антигенные и функциональные характеристики, вызывает нарушения проницаемости стенок микрососудов, сужение просвета и уменьшение площади их внутренней поверхности с развитием ишемии и нарушением трофики тканей. Одним из самых тяжелых осложнений СД является ангиосклероз [1, 16].

Исходя из вышеизложенного, важной задачей является поиск фармакологической коррекции метаболических нарушений и эндотелиальной дисфункции при СД. Современный период развития медицины характеризуется значительными достижениями в области создания лекарственных стредств на основе пептидов, изучением их клинической эффективности и обоснованием целесообразности применения в комплексной терапии различных заболеваний и патологических состояний. Особую значимость приобретает разработка пероральных лекарственных форм пептидных препаратов [7]. Подобный подход основан на существовании в организме системы биорегуляции, действующей посредством клеточных медиаторов, представляющих собой короткие пептиды, функцией которых является селективная передача информации при взаимодействии клеток иммунной, нервной и других систем, и образующихся в реакциях ограниченного протеолиза из белков-предшественников в непосредственной близости от соответствующих рецептивных систем. Система пептидных гормонов желу дочно-кишечного тракта представляет собой специфический эндокринный аппарат, который в значительной мере самостоятельно координирует последовательность и взаимодействие в функционировании желудка, поджелудочной железы, печени и кишечника. В экспериментах было показано, что ряд эндогенных пептидных гормонов стимулирует поджелудочную железу и выделение инсулина (инсулинотропный эффект) [5, 13, 22].В частности, гастроингибирующий пептид (ГИП) стимулирует выделение инсулина при повышенной концентрации глюкозы. Аналогично действует инкретин, выделяемый двенадцатиперстной и тощей кишкой в ответ на присутствие глюкозы.

В настоящее время некоторые короткие пептиды рассматриваются как потенциальные средства для лечения СД. Установлено гипогликемическое действие декапептидного фрагмента инсулина [3], аналогов пептида р277 — эпитопа человеческого белка теплового шока (hsp 60) [6], фрагментов С-пептида инсулина [2], коротких инсулинпотенцирующих пептидов [18].

Одним из перспективных пептидных биорегуляторов является тетрапептид KEDWa, синтезированный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [8]. Целью работы явилось молекулярногенетическое обоснование синтеза тетрапептида KEDWa, изучение его гипогликемического действия и влияния на функциональное состояние эндотелия при хронической гипергликемии в экспериментальных моделях аллоксанового и стрептозотоцинового СД у крыс.

Материалы и методы

Молекулярно-генетическое обоснование синтеза тетрапептида KEDWa. Проведен поиск структуры короткого пептида, который мог бы действовать как миметик инсулинотропных полипептидов. С этой целью исследовали аминокислотную последовательность инкретина [17]:

В составе инкретина подчеркнута часть полипептидной цепи, которая соответствует аминокислотной последовательности ГИП, за исключением остатка аргинина в позиции 61, который в составе ГИП заменен на гистидин. Оба инсулинотропных гормона содержат в структуре короткий участок из четырех аминокислотных остатков KNDW, который не обнаружен в составе других регуляторных пептидов человека [11].

Из островков поджелудочной железы морского конька Lophius americanus был выделен регуляторный пептид YG, имеющий аминокислотную последовательность

Он содержит участок цепи EDW, представляющий собой вариант последовательности NDW, в котором остаток аспарагина (N) заменен остатком глутаминовой кислоты Е.

Рассматривая возможность использования короткого пептида KNDW в качестве миметика природных инсулинотропных пептидов, следует учитывать его уязвимость со стороны протеиназ желудочно-кишечного тракта.

Известно, что трипсин гидролизует пептид ную связь лизина (и аргинина) с последующим аминокислотным остатком, так что связь KN может быть легко гидролизована трипсином из-за повышенной локальной плотности положительного заряда (лизин и амидная группа аспарагина). Замена аспарагинового остатка остатком глутаминовой кислоты обеспечивает локальную нейтрализацию заряда боковой группы лизина и защиту пептидной связи КЕ от действия трипсина. С другой стороны, пептидная связь WK и WA в составе природных полипептидов подвергается гидролизу химотрипсином. Химотрипсин специфически связывает большие гидрофобные боковые группы фенилаланина, тирозина и триптофана и разрывает их связь с последующим аминокислотным остатком, так что в условиях желудочно-кишечного тракта пептидная связь WK и WA представленных выше полипептидов подвергается гидролизу химотрипсином. Триптофан, расположенный на конце тетрапептида KEDWa, не будет атакован химотрипсином. Однако целесообразно амидировать концевую карбоксильную группу триптофана для защиты от возможного действия эластазы поджелудочного сока.

Таким образом, в качестве синтетического миметика инсулинотропных гормонов был сконструирован и синтезирован по оптимальной схеме тетрапептид KEDWa, защищенный от действия протеиназ желудочно-кишечного тракта [21]. Его биологическая активность была исследована в экспериментальных моделях аллоксанового и стрептозотоцинового СД у крыс. Известно, что аллоксан и стрептозотоцин обладают избирательным цитотоксическим действием на b-клетки поджелудочной железы крыс [19], и через 2–3 нед после их введения у экспериментальных животных развивается СД (перманентная гипергликемия, полиурия, глюкозурия).

Аллоксановый диабет. Эксперимент проведен на 18 белых беспородных крысах-самцах массой тела 340–410 г. После определения концентрации инсулина в крови животных их рандомизированно разделили на две группы: контрольную и опытную (8 и 10 крыс соответственно). Всем животным однократно внутривенно вводили по 1 мл раствора аллоксана в дозе 35 мг/кг веса. Через 15 сут у животных развился диабет, и концентрация инсулина в крови снизилась в 12–15 раз по сравнению с исходной (см. табл. 2). Затем животным контрольной группы начали вводить ежедневно внутрибрюшинно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора NaCl, а животным опытной группы — тетрапептид KEDWa в дозе 3 мкг (в 0,3 мл 0,9% раствора NaCl) на крысу в течение 11 сут.

Стрептозотоциновый диабет. Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар массой тела 170–210 г. С целью моделирования СД животным вводили стрептозотоцин (50 мг/кг веса внутрибрюшинно однократно в 1 мл 0,9% раствора NaCl). После введения стрептозотоцина животным 1-й опытной группы вводили тетрапептид внутримышечно (10 мкг в 1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное) ежедневно в течение 10 сут. Животным 2-й группы тетрапептид вводили перорально через зонд (100 мкг в 1 измельченной таблетке на 1 животное); объем вводимой взвеси составлял 2 мл ежедневно в течение 10 сут после введения стрептозотоцина. Крысы контрольной группы после введения стрептозотоцина по аналогичной схеме получали инъекции 0,9% раствора NaCl. Группой сравнения служили здоровые интактные животные. Каждая группа состояла из 20 животных. Определение глюкозы крови проводили натощак (корм убирали за 14 час) на 10, 15 и 20-е сут после введения стрептозотоцина. На 20-е сут после введения стрептозотоцина определяли диурез и глюкозу мочи. Исследование проницаемости и адгезивности эндотелия проводили на 20-е сут после введения стрептозотоцина.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета многомерного статистического анализа и программы обработки электронных таблиц Microsoft Excel 7.0 для Windows 95. Достоверность различий всех анализируемых показателей оценивали, используя t-кpитеpий Стьюдента и U-кpитеpий Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Аллоксановый диабет. Установлено, что после окончания введения тетрапептида у животных опытной группы наблюдалось повышение концентрации инсулина в крови, тогда как в контрольной группе инсулин в крови полностью отсутствовал (табл. 1).

Все животные с аллоксановым диабетом через 44 дня после окончания введения тетрапептида были использованы для оценки динамики усвоения глюкозы. Для этого им вводили внутривенно 1 мл 2% раствора глюкозы и измеряли ее уровень в крови в течение 2 ч. В качестве второго контроля использовали здоровых крыс с нормальным уровнем глюкозы в крови. После введения глюкозы здоровым крысам ее концентрация в течение 2 ч уменьшилась практически до начального уровня (рис. 1; 1).

Глюкоза, введенная животным с аллоксановым диабетом, получавшим пептид KEDWa, быстро усваивалась, и через 2 ч ее концентрация была ниже начального значения (рис. 1 график 3). Скорость усвоения глюкозы у крыс с экспериментальным диабетом, получивших курс лечения пептидом, была сопоставима с таковой у здоровых животных. При введении глюкозы крысам с аллоксановым диабетом (контрольная группа) начальная повышенная концентрация глюкозы в крови возрастала и в дальнейшем уменьшалась очень медленно, не достигая исходного значения (рис. 1; 2).

Механизм возникновения аллоксанового диабета заключается в следующем. Аллоксан по своему строению близок к природным пиримидиновым основаниям урацилу и тимину, поэтому может конкурировать с природными нуклеиновыми основаниями, встраиваясь по механизму интерколяции в структуры РНК и ДНК, и ингибировать синтез белков, в том числе инсулина. Вероятный механизм индукции биосинтеза инсулина пептидом KEDWa, по-видимому, обусловлен взаимодействием этого тетрапептида с промотерным участком гена препроинсулина. Связывание тетрапептида в большой канавке двойной спирали ДНК на промотерном участке гена, вероятно, может привести к конкурентному вытеснению аллоксана гидрофобной боковой группой остатка триптофана. Продуктом трансляции этого гена является препроинсулин. Сигнальный пептид этой молекулы облегчает мембранный переход предшественника инсулина и отщепляется после перехода. Полученная молекула проинсулина содержит пептидные цепи А и В, соединенные участком С. После энзиматического удаления этого участка между цепями А и В устанавливаются дисульфидные связи, специфические для природного инсулина.

Таблица 1

Влияние тетрапептида KEDWa на уровень инсулина в крови крыс с аллоксановым диабетом

* — P<0,001 по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Используя разработанный нами ранее подход к оценке комплементарных взаимодействий коротких пептидов с нуклеотидными последовательностями двойной спирали ДНК, мы определили последовательность нуклеотидов, которая может комплементарно связывать тетрапептид KEDWа в большой канавке ДНК [9, 10]. Эта последовательность составила 6 пар оснований ggcagg и cctgcc на ведущей цепи ДНК гена препроинсулина [23]. На промотерном участке этого гена (2423 п. о.) было обнаружено 14 таких участков, что может служить основанием для экспериментальной проверки гипотезы. На рис. 2 представлена проекция боковых групп тетрапептида, взаимодействующих с функциональными группами нуклеотидной последовательности ggcagg двойной спирали ДНК.

Таким образом, на основании анализа структуры инсулинотропных полипептидов сконструирован тетрапептид KEDWa, обладающий способностью инициировать транскрипцию гена и синтез инсулина при аллоксановом диабете у крыс.

Стрептозотоциновый диабет. В результате проведенного исследования установлено, что на

10-е сут после введения стрептозотоцина у 30%, а на 20-е сут — у большей части экспериментальных животных, по данным биохимических анализов крови и мочи, был диагностирован СД, что соответствует литературным данным по данной модели (табл. 2, рис. 3). У животных, получавших тетрапептид перорально, на 10-е сут отмечен его выраженный гипогликемический эффект: число животных с гипергликемией было вдвое меньше, чем в контрольной группе после введения стрептозотоцина. После прекращения приема тетрапептида эффект не сохранялся, и к 20-м сут показатели у крыс этой группы практически не отличались от контроля (рис. 3).

К 20-м сут после введения стрептозотоцина показатели, отражающие морфофункциональное состояние эндотелия, значительно изменялись. Проницаемость сосудистой стенки у большей части животных с СД снижалась по сравнению с контролем. Тетрапептид не оказывал влияния на этот показатель транскапиллярного обмена при внутримышечном и пероральном применении (табл. 2). Адгезивность эндотелия сосудистой стенки у животных, не получавших тетрапептид, снижалась. Внутримышечное введение тетрапептида восстанавливало адгезивные свойства эндотелия, при этом значения данного показателя практически не отличались от таковых у здоровых животных, причем, вне зависимости от уровня глюкозы крови. При пероральном применении тетрапептид не оказывал влияния на адгезивность эндотелия (табл. 2). Таким образом, парентеральное введение тетрапептида оказывало долгосрочное эндотелиопротекторное влияние, а пероральный прием — кратковременный гипогликемический эффект (только в период приема тетрапептида).

Таблица 2

Влияние тетрапептида KEDWa на уровень глюкозы крови, показатели адгезивности и проницаемости у животных с стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом

* — Р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у здоровых животных; ** — Р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем у здоровых животных;

#— Р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у животных контрольной группы после введения стрептозотоцина; ##— Р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем у животных контрольной группы после введения стрептозотоцина.

По данным литературы, начальные морфофункциональные изменения сосудистой стенки обнаруживаются у крыс через 1–2 мес после введения стрептозотоцина. Описано накопление плотных гранул в цитоплазме и митохондриях эндотелиальных клеток капилляров сетчатки, а также утолщение базальной мембраны клубочковых капилляров в почках, коррелирующее с уровнем гликемии [14, 15, 24]. Выявлено, что изменения со стороны эндотелия при СД проявляются появлением отека эндотелиоцитов, снижением в них количества органелл и пиноцитозных пузырьков, увеличением количества цитоплазматических выростов и микроворсин, впадающих в просвет капилляра и препятствующих кровотоку. Некоторые капилляры полностью выключаются из кровотока в связи с обтурацией просвета. В результате этого число функционирующих капилляров уменьшается, что приводит к нарушению микроциркуляции и ишемии. Важную роль в механизме развития нарушений микроциркуляции играют изменения реологических свойств крови и гемостаза [1, 4].

Результаты исследований в экспериментальных моделях аллоксанового и стрептозотоцинового СД у крыс показали, что тетрапептид KEDWaпри кратковременном внутримышечном и пероральном применении оказывает значительное гипогликемическое и эндотелиопротекторное действие. Это открывает перспективу создания нового лекарственного препарата для использования в терапии больных СД.

Авторы выражают благодарность академику

РАМН И.П. Ашмарину, профессору Л.К. Шатаевой, профессору Н.А. Гавришевой, канд. хим. наук Е.И. Григорьеву и канд. биол. Наук А.М. Ульянову за помощь в работе.

* * *

Литература

1. Балаболкин М. И. Патогенез и механизм разви тия ангиопатий при сахарном диабете // Кардиология. 2000. № 10. С. 74–87.

2. Варен К., Йоханссон Б.-Л., Йернвалль Х. С-пептиды инсулина. Патент РФ № 99108434. 2001

3. Дюмаев К. М., Княжев В. А., Арчаков А. И. и др. Пептидный фрагмент, обладающий биологиской активностью инсулина. Патент РФ № 2078769. 1997.

4. Ефимов А. С. Диабетические ангиопатии. М.: Медицина, 1989. 287 с.

5. Климов П. К. Пептиды и пищеварительная сис тема. Л.: Наука, 1983. 372 с.

6. Кохен А. Р., Елиас Д., Фридкин М. Аналоги пептида р277 и содержащие их фармацевтические композиции для лечения и диагностики диабета. Патент РФ № 2159250 С2. 2000.

7. Тутельян В. А., Хавинсон В. Х., Малинин В. В. Физиологическая роль коротких пептидов в питании // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2003. Т. 135. № 1. С. 4–10.

8. Хавинсон В. Х., Малинин В. В., Григорьев Е. И., Рыжак Г. А. Тетрапептид, регулирующий уровень глюкозы при сахарном диабете, фармакологическое средство на его основе и способ его применения. Патент РФ № 2242241. 2004.

9. Хавинсов В. Х., Шатаева Л. К., Бондарев И. Э. Модель воздействия регуляторных пептидов с двойной спиралью ДНК // Успехи соврем. биол. 2003. Т. 123 № 5. С. 467–474.

10. Шатаева Л. К., Хавинсон В. Х., Ряднова И. Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы). СПб.: Наука, 2003. 222 с.

11. Шатаева Л. К., Ряднова И. Ю., Хавинсон В. Х. Исследование информационной ценности олигопептидных блоков в регуляторных пептидах и белках // Успехи соврем. биол. 2002. Т. 122. № 3. С. 282–289.

12. Arikawa E., Cheung C., Sekirov I. et al. Effects of endothelin receptor blockade on hypervasoreactivity in streptozotocin-diabetic rats: vessel-specific involvement of thromboxane A2 // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2006. Vol. 84. № 8–9. P. 823–833.

13. Ashcroft F. M., Ashcroft S. J. H. Mechanism of insulin secretion / Insulin: Molecular Biology to Pathology. Oxford: IRL Press, 1992. P. 97–150.

14. Babel J., Leuenberger P. A long term study on the ocular lesions in streptozotocin diabetic rats // Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 1974. Vol. 189. №3. P. 191–209.

15. Fox C. J., Darby S. C., Ireland J. T., Sonksen P. H. Blood glucose control and glomerular capillary basement membrane thickening in experimental diabetes // Br. Med. J. 1997. Vol. 2. № 6087. P. 605–607.

16. Harhaj N. S., Felinski E. A., Wolpert E. B. et al. VEGF activation of protein kinase C stimulates occludin phosphorylation of and contributes to endothelial permeability // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. Vol. 47. № 11. P. 5106–5115.

17. Higashimoto Y., Liddle R. A. Isolation and characterization of the gene encoding rat glucose-dependent insulinotropic peptide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 193. № 1. P. 182–190.

18. Ng Frank Man-Moon, Jiang Woei-Ji. Insulin potentiating peptides. EP 1268518. 2001.

19. Rerut C., Tarding F. Streptozotocin and alloxan-diabetes in mice // Eur. J. Pharmacol. 1969. Vol. 7. №1. P. 89–96.

20. Rodella L., Lamon B. D., Rezzani R. et al. Carbon monoxide and biliverdin prevent endothelial cell sloughing in rats with type I diabetes // Free Radic. Biol. Med. 2006. Vol. 40. № 12. P. 2198–2205.

21. Sewald K., Jakubke H.-D. Peptides: Chemistry and Biology. WILEY-VCH Verlag GmH. Wemheim, 2002. 562 p.

22. Tseng C. C., Jarboe L. A., Landau S. B. et al. Glucose-dependent insulinotropic peptide: structure of the precursor and tissue-specific expression in rat // J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. Vol. 90, № 5. P. 1992–1996.

23. Ullrich A., Dull T. J., Gray A. et al. Generic variation in the human insulin gene // Science. 1980. Vol. 209. №. 4456. P. 612–615.

24. Wehner H., Majorek B. Early glomerular changes in streptozotocin diabetes of the guinea pig // Virchows Arch. 1975. Vol. 368. № 3 p. 179–189.